Al meer dan 20 jaar stond marien bioloog Mary Hagedorn voor een schijnbaar hardnekkig probleem. Ze zocht naar een manier om de embryo's van zebravissen te bevriezen en te ontdooien.
Een belangrijk experimenteel dier, zebravisgenen, benaderen die van mensen dicht genoeg zodat ze zijn gebruikt om ziekten zoals spierdystrofie en melanoom te onderzoeken. Als het reproductiemateriaal gemakkelijk zou kunnen worden ingevroren en ontdooid, zouden die studies gemakkelijker uit te voeren en te repliceren zijn, omdat onderzoekers niet zouden moeten werken rond paaischema's of strijd tegen genetische drift.
Het probleem komt neer op de manier waarop vissen zich voortplanten. Wetenschappers bevriezen al tientallen jaren succesvol - of cryopreservatie, om de technische term te gebruiken - en ontdooien van levensvatbaar sperma en eieren van veel dieren. Maar viseieren ontwikkelen zich buiten het lichaam van de ouder, wat fysiologische uitdagingen oplevert die niet aan de orde komen wanneer u met cellen van vee of zelfs mensen werkt. Het ei bevat de voedingsstoffen die het ontwikkelende embryo nodig heeft en heeft ook zijn eigen pantser, wat betekent dat die eieren groot zijn en vaak zijn ingekapseld in een relatief ondoordringbaar membraan.
Simpel gezegd, de visseieren zijn meestal te groot om onder normale omstandigheden snel te bevriezen of te ontdooien. Hagedorn - die als onderzoeksbioloog werkt bij het Centre for Species Survival van het Smithsonian's National Zoo and Conservation Institute - vergelijkt ze met planeten. Zoogdiereieren lijken meestal meer op de kleinere leden van ons zonnestelsel - zeg maar, Mercurius. Een zebravis-ei staat dichter bij een reus als Jupiter.
"Als je weefsel niet goed bevriest, zullen er ijskristallen in komen en ze zullen de cellen doorboren en vernietigen, " zegt Hagedorn.
Ze bracht 12 jaar op zoek naar een oplossing, uiteindelijk tot een nieuwe oplossing die micro-injectie van een "cryoprotectant" (een antivries, eigenlijk) in de eieren betrokken, een techniek die dat agent toegestaan om het beschermende membraan te omzeilen. Goed gekalibreerd om vergiftiging van de cellen te voorkomen, kunnen die beschermers ervoor zorgen dat een ei gelijkmatig vitrificeert (glasachtig wordt) wanneer het in een bad met vloeibare stikstof wordt ondergedompeld.
"Als je weefsel niet goed invriest, zullen er ijskristallen in komen en ze zullen de cellen doorboren en vernietigen, " zegt Mary Hagedorn over het probleem dat ze tegenkwam bij het bevriezen van zebravisembryo's. (Encyclopedia of Life / Bioimages) Hoewel dat proces visembryo's effectief in een staat van zwevende animatie kon brengen, bleef het weer opwarmen een probleem. Terwijl ze warm worden, is er een tussenpunt tussen de ideale glasachtige toestand en kamertemperatuur, waar zich opnieuw ijskristallen kunnen vormen. En die kristallen kunnen het celmateriaal beschadigen, waardoor het niet verder kan worden ontwikkeld.
"We moesten ze veel sneller ontdooien, " zei Hagedorn. “Met behulp van de tools die we in 2011 hadden. . . Ik raakte een muur. '
Een tijdje gaf ze het op.
En zo was het misschien gebleven als er geen toevallige ontmoeting was geweest tijdens een cryoconserveringsconferentie ergens in 2013, waar ze een presentatie hoorde van John Bischof, een hoogleraar werktuigbouwkunde aan de Universiteit van Minnesota.
Zoals Bischof het vertelt, had hij gepresenteerd over een niet-gerelateerd onderwerp met betrekking tot ijzeroxide nanodeeltjes, dat zijn laboratorium heeft gebruikt bij het veilig opnieuw opwarmen van menselijk weefsel voor transplantatie. Zijn onderzoek klikte met Hagedorn en vroeg haar na te denken over het potentieel voor niet-zoogdiertoepassingen.
"Ze zei: Wat kun je doen om me te helpen met de embryo's, " herinnert Bischof zich.
Die eerste vraag gaf aanleiding tot een complexe, voortdurende interdisciplinaire samenwerking - een waarin zowel Hagedorn als Bischof aandringen op het belang van het werk van de ander.
Hun resultaten, die deze week in het tijdschrift ACS Nano zijn gepubliceerd, geven aan dat het misschien mogelijk is om ingevroren visembryo's toch veilig opnieuw te verwarmen.
De inspiratie voor hun werk kwam van de inspanningen van een inmiddels overleden wetenschapper genaamd Peter Mazur, die dacht dat het mogelijk zou zijn om ingevroren embryo's opnieuw te verwarmen met lasers. (Ja, lasers.) Hoewel het idee potentieel goed was, is het een uitdaging, vertelde Hagedorn me, om lasers warmte te laten overbrengen naar biologisch materiaal. Samen met een andere onderzoeker genaamd Fritz Kleinhans, echter, bedacht Mazur dat het mogelijk zou kunnen zijn om een andere stof in de oplossing met het embryo te introduceren, een die warmte van de laser zou opnemen en over zou dragen aan de biologische materie.
In het geval van Mazur betekende dat roet in de vorm van India-inkt, een stof die warmte goed absorbeert en transporteert - en een die, zegt Kleinhans, je gewoon kunt kopen op Amazon.com. Als het bijvoorbeeld rond een bevroren muizenembryo zou worden geplaatst, zou een enkele laserpuls het cellulaire materiaal bijna onmiddellijk op kamertemperatuur kunnen brengen, waarbij de tussenliggende fase van opwarming wordt overgeslagen waar zich ijskristallen dreigen te vormen. Kleinhans zegt dat ze in de eerdere fase van het werk van Hagedorn had gehoopt dat de techniek ook zou kunnen werken voor embryo's van zebravissen. Helaas waren ze nog steeds te groot, en tegen de tijd dat externe hitte zijn weg vond naar het centrum, vormden zich al fatale ijskristallen.
Toen Hagedorn, Bischof en hun medewerkers in hun nieuwe artikel schreven, was er echter een andere manier. Het verspreiden van Indiase inkt op de buitenkant van het embryo is misschien niet voldoende geweest, maar wat als ze wat ander reagerend materiaal erin hadden gestopt voor het invriezen? Om dit te doen, vestigden ze zich op gouden nanostaafjes - minuscule moleculaire structuren, orden van grootte kleiner dan een mensenhaar - die ze samen met antivriesmiddelen in het embryo micro-injecteerden voorafgaand aan conservering, met behulp van de methoden die Hagedorn jaren eerder had uitgewerkt.
Zoals de onderzoekers in hun artikel schrijven: "Deze nanodeeltjes kunnen effectief warmte genereren wanneer de lasergolflengte overeenkomt met de oppervlakte-plasmonresonantie-energie van het gouden nanodeeltje." Dat is een gecompliceerde manier om te zeggen dat de nanodeeltjes de energie kunnen absorberen en versterken door een korte lichtflits.
Goud vertoont, net als veel andere stoffen, andere eigenschappen op nanoschaal dan in bulk. Een goed gekalibreerde milliseconde laserpuls kan een embryo plotseling opwarmen door middel van het goud dat er doorheen wordt verdeeld, en het opnieuw opwarmen met een verbazingwekkende snelheid van 1, 4 x 10 7 ° C per minuut, een bijna ondoorgrondelijke temperatuur die beheersbaar is in de snelle bursts die de onderzoekers in dienst.
"In die ene milliseconde puls van de laser ga je van vloeibare stikstof naar kamertemperatuur, " zegt Bischof. Het is veelzeggend dat, anders dan elke andere methode die Hagedorn eerder had geprobeerd, de resultaten heet genoeg waren - en wijd verspreid genoeg - om met succes een heel zebravisembryo in één keer opnieuw te verwarmen.
Met die barrière eindelijk overgestoken, bleven er vragen. De belangrijkste daarvan was of die embryo's nog steeds levensvatbaar zouden zijn. Zoals de onderzoekers in hun paper melden, was dit een aanzienlijk deel, hoewel niet allemaal. Van degenen die ze ontdooiden, bereikte 31 procent het slechts een uur na opwarming, 17 procent overschreed de grens van drie uur en slechts 10 procent ontwikkelde zich nog steeds na de 24 uur.
Hoewel dat misschien klein klinkt, is het veel groter dan het overlevingspercentage van nul procent dat eerdere methoden hadden opgeleverd. Hagedorn hoopt dat toekomstige werkzaamheden die cijfers verder zullen "verbeteren". En ze blijft positief over zelfs het cijfer van 10 procent. "Een vis kan miljoenen eieren produceren, en als ik er 10 procent van zou bevriezen, is dat een heel goed aantal, " zegt ze.
Natuurlijk zou het worstelen met miljoenen eieren vereisen dat ze het proces voor efficiëntie verder transformeren. Op dit punt valt veel van dat werk op de schouders van Bischof en anderen in zijn laboratorium, waar al wordt gewerkt aan het verbeteren van de "doorvoer" van het proces, waardoor het mogelijk een meer industriële onderneming wordt. "Ik denk dat er een aantal ondersteunende technologieën zullen zijn die de komende jaren daarop zullen worden ontwikkeld, " vertelde hij me.
Als dat werk slaagt, denkt Hagedorn dat het andere toepassingen zou kunnen hebben die veel verder gaan dan de bescheiden zebravis.
"Veel aquacultuurboeren willen vis [reproductief materiaal] bevriezen, omdat ze maar één keer per jaar spawnen, " zei ze. “Je hebt dit boeiende aspect van het runnen van hun boerderijen. Als je de embryo's op een meer geplande manier uit de vriezer zou kunnen halen, zou het voedsel goedkoper en betrouwbaarder worden. ”
Het kan ook een impact hebben op natuurbehoud. Hagedorn, die tegenwoordig voornamelijk met koraal werkt, denkt dat het ons kan helpen beschadigde riffen te repareren. Ze suggereert ook dat het uiteindelijk de uitgeputte kikkerpopulaties zou kunnen herstellen en misschien ook andere soorten kan redden. Ongeacht waar het werk ons in de toekomst naartoe brengt, het is echter een bewijs van het potentieel van wetenschappelijke samenwerking vandaag.
“In het begin voelde het eerlijk gezegd niet echt. Het is biologisch logisch dat we het zouden kunnen doen, maar het leek alsof we nooit alle stukken bij elkaar zouden krijgen, 'vertelde ze me. “Als ik tijdens die bijeenkomst niet naast John was gaan zitten, hadden we dit nooit gedaan. Zonder onze gezamenlijke inspanningen - de engineering en de biologie - zou dit niet zijn gebeurd. "
